Результаты последних исследований рода Zoogloea (Зооглея) и его молекулярная систематика
Авторы: Йонг Кук Шин, Акира Хираиши, Джанта Сагияма
Институт молекулярных и клеточных биологических наук, Университет Токио, находящийся в Yayoi 1-1-1, Bunkyo-ku, Токио 113, и Лаборатория экологической биотехнологии (Компания Konishi Co.), расположенная в Yokokawa, Sumida-ku, Токио 130, Япония. Филогенетические родство среди штаммов зооглей и родственных таксонов было выявлено методом секвирования рибосомной ДНК 16s и гибридизацией геномной ДНК. Ген рибосомной ДНК 16s был усилен цепной реакцией полимеразы с парой эубактериальных согласованных праймеров и упорядочен использованием автоматизированного флуоресцентного секвенатора ДНК. Последовательное сопоставление и анализ дерева матричных расстояний показали, что Zoogloea ramigera IAM 12136 (= N. C. Dondero 106, типичный штамм) и зооглея вида ATCC 19324 образуют общий род с Rhodocyclus purpureus в подклассе «f3» протеобактерий, а Zoogloea ramigera IAM 12670 (= P. R. Dugan 115) принадлежит другой группе с Akaligenes eutrophus и Pseudomonas cepacia в подклассе «B». И наоборот, оказалось, что штамм Z. ramigera IAM 12669 (= K. Crabtree I-16-M), входит в подкласс «Y» протеобактерий, имеющий близкое родство с Agrobacterium tumefmiens. Изучение гибридизации геномной ДНК также показало, что среди штаммов, обозначенных Z. ramigera, существует генетическое многообразие, однако типичные штаммы зооглей, характеризующиеся производством родохинонов, плотно связаны друг с другом и могут рассматриваться как один вид. На основе молекулярных данных, а также ранее известной фенотипичной и хемотаксономичной информации нами были внесены уточнения в описание рода Zoogloea.
Штаммы рода Zoogloea Itzigsohn 1868, который сегодня включает только один вид, Zoogloea ramigera, являются грамотрицательными аэробными хемоорганотрофными бактериями, способными к формированию так называемых зооглей, которые являются хлопьевидными массами клеток, плавающими в студенистом межклеточном материале и характеризующимися разветвленной пальцевидной морфологией (8, 33). Поскольку морфологически подобные бактериальные хлопья часто встречаются в биопленке и системах активного ила, предполагается, что организмы зооглей могут сыграть важную роль в процессах очистки сточных вод.
Способность зооглей к образованию хлопьев долгое время использовалась в качестве важного критерия при классификации и идентификации штаммов зооглей, поскольку других отличных черт, подходящих для этой цели, попросту не существовало. Однако данная способность сама по себе обнаружена не только в штаммах зооглей, но также и во многих других штаммах метаболически сходных бактерий, живущих в сточных водах (3, 19, 21, 31). К сожалению, исходный изолят наряду с другими ранними штаммами зооглей (1, 7, 11, 22,34) не сохранились, а потому провести их сравнительный таксономический анализ невозможно. Такая ситуация породила противоречивые утверждения и порядочную путаницу в таксономии и номенклатуре рода Zoogloea, что наблюдается у Звирбалиса и Хатта (38). В 1967 году Крабтри и Маккой (2) предложили назвать штамм I-16-M неотипом штамма Z. ramigera. Однако, несколько лет спустя, Унц (32) в прошении о заключении эксперта предложил отказаться от штамма I-16-M как неотипа и заменить его штаммом 106, поскольку прежний был неспособен к образованию настоящих зооглей, так называемых Itzigsohn (1868), в своем первоначальном описании этого вида. После внесения данного предложения таксономическая путаница относительно рода Zoogloea начала проясняться, однако текущий статус рода все еще остается неудовлетворительным.
Существует три штамма Z. ramigera известные своим экспериментальным использованием: 106T (T = типичный штамм) (32), I-16-M (2) и 115 (8, 10). Они выделены из сточных вод и обладают свойством образовывать хлопья, но имеют значительные фенотипичные различия. Было предложено убрать два последних штамма из рода Zoogloea на основе фенотипичных расхождений. В предыдущем исследовании нами был использован хемотаксономичный инструментарий, чтобы решить таксономическую проблему рода Zoogloea (17). Самым поразительным оказался тот факт, что типичные штаммы зооглей в дополнение к убихинону-8 (Q-8), как главному органическому соединению, характеризуются производством необычного хинона, родохинона-8 (RQ-8), тогда как штаммы Z. ramigera I-16-M и 115 образуют его в недостаточном количестве. Хемотаксономичные данные подтверждают результаты ранних фенотипичных исследований, уточняют информацию о роде Zoogloea и предлагают эффективный родохиноновый анализ в качестве нового инструмента для идентификации штаммов зооглей.
Род Zoogloea исторически считается частью семьи Pseudomonadaceae (25, 26), но данное утверждение является предполагаемым и базируется лишь на фенотипичной информации.
Филогенетические связи штаммов зооглей с другими псевдомонадами пока не объяснимы. Целью данного исследования является определение внутри - и межродовых отношений среди штаммов зооглей и родственных таксонов при помощи молекулярных методов. Применяемая стратегия заключается в усилении цепной реакции полимеразы (ЦРП) и прямом автоматизированном секвенировании рибосомной ДНК 16s, проведении компьютеризированного филогенетического анализа, прямого хроматографического анализа основного состава ДНК, а также колориметрического исследования ДНК-ДНК гибридизации. На основании молекулярных данных и ранее известной фенотипичной и хемотаксономичной информации (16, 32, 33) нами были внесены уточнения в описание рода Zoogloea.
Материалы и методы
Штаммы бактерий и культивирование. В данном исследовании использовались преимущественно три штамма Z. ramigera: IAM 12136 (= штамм 106T), IAM 12669 (= штамм I-16-M) и IAM 12670 (= штамм 115), а также зооглея вида ATCC 19324. Кроме того при изучении гомологии ДНК были использованы штаммы ATCC 19173, ATCC 19123, AS180, AS456 и AS480. В качестве контрольных организмов были добавлены несколько штаммов устоявшихся видов протеобактерий подкласса «р» (28). Перечень штаммов, подвергшихся исследованию, можно увидеть в таблице 2. Штаммы с IAM номерами были получены из Центра коллекции культур Института прикладной микробиологии, Университет Токио (Токио, Япония); штаммы с ATCC номерами поступили из Американской коллекции типовых культур (Роквил, штат Мэриленд), и, наконец, штаммы с номерами AS – из нашей коллекции (17). Среда определенного химического состава, называемая LYS (17), использовалась для разведения штаммов зооглей, в то время как сложная среда, называемая PBY (16), использовалась для всех других организмов. Клетки были выращены аэробно в пробирках или колбах Эрленмейера на вибрационных возвратно-поступательных шюттель-аппаратах при температуре 30С, собраны путем центрифугирования на ранней стационарной фазе роста, промыты соляным раствором с применением ЭДТК (0,15 м. ЭДТК плюс NaC1 на 0,15 м., pH фактор 8,5) и до использования хранились при температуре -20C.
Извлечение ДНК. Геномная ДНК была извлечена и очищена методом Мармура (23). Поскольку очистить ДНК от штаммов зооглей при наличии студенистого межклеточного материала оказалось сложно, до начала процесса извлечения клетки были обработаны 0,1 N NaOH в течение 10 минут при температуре 4C, чтобы удалить этот студенистый материал, а затем дважды промыты холодным соляным раствором с ЭДТК.
Усиление рибосомной ДНК 16s. Ген рибосомной ДНК 16s был усилен ЦРП, для осуществления которой в качестве матрицы использовался 1 лист геномной ДНК при 100-кратном объеме реакции. Реакция была выполнена в стандартных цикличных условиях с использованием имеющегося в свободной продаже комплекта реактивов ЦРП и ряда эубактериальных согласованных олигодезоксинуклеотидных праймеров, как уже было описано ранее (13). Усиленную ДНК обработали хлороформом с осадком этанола и очистили электрофорезом в агарозном геле, из которого она была извлечена с помощью комплекта Sephaglas BandPrep (Pharmacia LKB Биотехнология, Упсала, Швеция), что указанно производителем.
Секвенирование. Для проведения реакций секвенирования были использованы пять олигодезоксинуклеотидных праймеров, маркированных флуоресцинизотиоцианатом в 5 местах. Четверо из вышеуказанных праймеров совпали с набором позиций от 1406 до 1389, от 1111 до 1093, от 821 до 803 и от 536 до 518 в нумерации рибосомной ДНК 16s кишечной палочки, как было описано ранее (13). Оставшийся праймер оказался гомологичным ряду позиций от 1091 до 1109 (5-TAAGTCCCGCAACGAGCGC-3) в системе нумерации данного микроорганизма. Все пять праймеров были предоставлены компанией Takara Suzo Co. (Киото, Япония). Реакции секвенирования были проведены методом линейного секвенирования ЦРП (циклическое секвенирование) при помощи реактивов компании Pharmacia AutoCycle, что также было описано ранее (13). До проведения анализа реакционные смеси хранились при температуре -20C. Непосредственно перед процедурой электрофореза они были денатурированы путем нагрева при 95C в течение 3 минут, а затем быстро охлаждены в ледяной воде.
При выполнении автоматизированного электрофореза и анализа последовательных реакций ДНК был использован секвенатор с 0,5-мм спейсерами и 5%-ым акриламидным гелем производства компании Pharmacia A.L.F.
Филогенетический анализ данных. Последовательности были компилированы согласно данным о перекрывающих клонах, обработанным автоматически и вручную, выровнены и рассчитаны на наличие сходства посредством программы GENETYX (Software Development Co., Токио, Япония) на персональном компьютере Apple Macintosh. Расчет скорости нуклеотидного замещения (20) и построение дерева матричных расстояний было выполнено методом ближайшего связывания (27) с помощью программы CLUSTAL V (12).
Промежутки при выравнивании и неопределенные или сомнительные основные позиции при вычислениях не учитывались.
В программе CLUSTAL V также использовался параметр «бутстрап», который запускался 1000 раз с целью передачи интервалов со степенью достоверности каждому узлу филогенетического дерева.
Состав оснований ДНК и гибридизация геномной ДНК.
Состав оснований ДНК (гуанин [G] + цитозин [C]) был определен путем высокоэффективной жидкостной хроматографии гидролизатов нуклеазы P1 геномной ДНК по внешним стандартам нуклеотидов (Ямаса Шою, Choshi, Япония) (14, 18). Исследования ДНК-ДНК гомологии были выполнены методом количественной дот-блот гибридизации с маркированием фотобиотином и колориметрическим распознаванием (9, 14).
Порядковые номера нуклеотидов. В базах данных последовательности нуклеотидов GenBank, DDBJ и EMBL должна появиться следующая информация об их порядковых номерах: Z. ramigera IAM 12136T, D14254; Z. ramigera IAM 12669, D14255; Z. ramigera IAM 12670, D14256; и штамм ATCC 19324, D14257. Порядковые номера организмов, используемых в качестве контрольных, следующие: Agrobacterium tumefaciens, M11223; Alcaligenes eutrophus, M32021; Alcaligenes faecalis, M22508; Alcaligenes xylosoxidans, M22509; Chromobacterium violaceum, M22510; Comamonas testosteroni, M11224; E. coli (кишечная палочка), 501859; Neisseria gonorrhoeae, X07714; Pseudomonas aeruginosa, M34133; Pseudomonas cepacia, M22518; Pseudomonas diminuta, M59064; Rhodocyclus purpureus, M34132; Rochalimaea quintana, M11927; а также Spirillum volutans, M34131.
Результаты
Последовательное сопоставление. Фрагменты рибосомной ДНК 16s, которые соответствовали позициям от 7 до 1510 нуклеотидного ряда нумерационной системы кишечной палочки, были усилены ЦРП из четырех штаммов зооглей и непосредственно упорядочены с помощью лазерного флуоресцентного секвенатора ДНК Pharmacia. Установленные последовательности охватывают приблизительно 95 % всей молекулы рибосомной РНК 16s. Их количество в некоторой степени колеблется от штамма к штамму в пределах от 1 406 до 1 460 оснований, что происходит из-за потерь и добавлений нуклеотидов, обнаруженных в этих штаммах. Рибосомные ДНК 16s штамма Z. ramigera IAM 12136T и вида Zoogloea ATCC 19324 характеризуются потерей 3 пар в петле в позициях 77 - 92, добавлением гуанина в спирали петли в позициях 840 - 846, а также потерей в позиции 1140.
Z. ramigera IAM 12670 имеет несколько другие особенности, включая потерю 1 основания в спирали петли в позициях 840 - 846 и 6 оснований в петле в позициях 1131 - 1141. Последовательности рибосомной ДНК 16s трех вышеупомянутых штаммов имеют определенные отличительные черты подгруппы «f3» класса протеобактерий, о котором сообщает Вёзе (36). И наоборот, рибосомная ДНК 16s штамма Z. ramigera IAM 12669 характеризуется большими потерями в позициях 73 - 96, 200 – 217, 452 - 479 и дополнением 2 оснований в позициях между 1010 и 1011 – чертами, благодаря которым этот штамм относится к подклассу «а» протеобактерий.
Последовательности, о которых здесь идет речь, сравнивались с данными о 14 последовательностях РНК 16s типичных представителей класса протеобактерий, в основном относящихся к подклассу f3. В таблице 1 показаны попарные сравнения последовательностей, выполненные компьютером, где в верхнем правом треугольнике даны общие процентные значения сходства, а в нижнем левом - уточненные значения, которые были рассчитаны на основе 1 250 однозначно определенных позиций всех последовательностей ряда.
Между штаммами Z. ramigera IAM 12136T и Zoogloea вида ATCC 19324 было отмечено почти 100 % сходство: оба содержат RQ-8 в качестве основного хинона, как и типичные штаммы зооглей (17). Среди организмов, участвующих в сравнении, данные штаммы зооглей оказались наиболее подобными фототрофной бактерии R. purpureus (91.3 %). Типичные штаммы зооглей имеют мало сходных черт (менее 90%) с Z. ramigera IAM 12669 и IAM 12670, содержащими недостаточное количество родохинона. Относительно близкое сходство было обнаружено между Z. ramigera IAM 12670 и A. eutrophus (90.5 %), а также между Z. ramigera IAM 12669 и A. tumefaciens (95.2 %).
Анализ филогенетического дерева. Дерево матричных расстояний восстановлено методом ближайшего связывания по уточненным значениям, показанным в таблице 1. Данное филогенетическое дерево изображено на рис. 1. Топология дерева была оценена с помощью метода «бутстрап». Ветви, которые, возможно, показывают монофилетические фракции родственных организмов, разделенных узлами, содержат достоверные значения. Филогенетический анализ показал, что типичные штаммы Zoogloea (IAM 12136T и ATCC 19324) образуют общий род с R. purpureus в пределах подкласса «p» протеобактерий. Узел, определяющий эти организмы как монофилетическую группу, был поддержан методом «бутстрап» на 78 %. Z. ramigera IAM 12670 отнесли к другому роду, который этот штамм образовал с A. eutrophus и P. cepacia в пределах подкласса «p», и эта связь поддержана «бутстрапом» на 55 %. И наоборот, штамм Z. ramigera IAM 12669 оказался сильно разветвленным и «произрастающим» из группы, охватывающей представителей подкласса «p», а также состоящим в родстве с A. tumefaciens, представителем подкласса «а» протеобактерий.
Узел, определяющий эти организмы как монофилетическую группу, был поддержан методом «бутстрап» на 50 %.
Состав оснований ДНК и гомология ДНК-ДНК. Среди организмов, используемых в данном исследовании, находятся несколько штаммов зооглей, для которых еще не было придумано специальное название.
Оказалось, один из таких штаммов, зооглея вида ATCC 19324, имеет тесное филогенетическое родство с Z. ramigera IAM 12136T по сопоставлению последовательностей рибосомной ДНК 16s.
Чтобы узнать больше о внутриродовой структуре штаммов зооглей, нами был изучен состав оснований ДНК и связанность ДНК-ДНК среди этих штаммов по сравнению с другими родственными таксонами.
Эти результаты отображены в таблице 2, в которой также для сравнения показаны профили хинона испытуемых организмов.
Согласно предыдущим отчетам отношение оснований ДНК типового штамма Z. ramigera составило 65,3 % молекулярной массы, что определяется его плавучей плотностью (32, 33). Проведенные в ходе данного исследования эксперименты с высокоэффективной жидкостной хроматографией выявили, что содержание гуанина и цитозина в ДНК штаммов зооглей, производящих RQ-8, включая Z. ramigera IAM 12136T, колеблется в диапазоне от 67,7 до 69,0 % молекулярной массы, что значительно выше для типичных штаммов, чем считалось ранее. Используемый аналитический метод заключался в непосредственном измерении нуклеотидов, извлеченных из геномных ДНК, и таким образом должен был дать более точную информацию.
Штаммы Z. ramigera IAM 12669 и IAM 12670, имеющие недостаток родохинона, показали наличие гуанина и цитозина в гораздо меньших количествах, чем аутентичные штаммы зооглей. Исследования ДНК-ДНК гибридизации показали, что штаммы, содержащие RQ-8, связаны друг с другом близким родством, при этом величины их реассоциации составляют более 72%. Как и ожидалось, генетической связи между типичными штаммами зооглей и штаммами с недостатком родохинона либо контрольными организмами, используемыми для подкласса «p» протеобактерий, не существует.
Обсуждение
Результаты данного исследования показывают филогенетическую неоднородность среди трех существующих штаммов Z. ramigera и филогенетическое единство между Z. ramigera IAM 12136T и другими штаммами зооглей, содержащими родохиноны.
Основанный на последовательности филогенетический анализ рибосомной ДНК 16s показывает, что типичный штамм Z. ramigera и штамм вида ATCC 19324 образуют общий род внутри подкласса «p» протеобактерий, а R. pulpureus является их ближайшим «родственником». Становится очевидным, что название рода Zoogloea должно использоваться для ограниченного числа штаммов, принадлежащих данной филогенетической группе. На филогенетическом дереве Z. ramigera IAM 12670 располагается на другой ветви внутри подкласса «p» вместе с A. eutrophus и P. cepacia, причем последняя бактерия была перенесена в новый род, Burkholderia, как Burkholderia cepacia (37). Данный факт предполагает удаление штамма Z. ramigera IAM 12670 из рода Zoogloea и повторное его классифицирование, возможно, как новый род с видами, родственными двум вышеупомянутым таксонам. Поскольку любой штамм, подобный IAM 12670 с названием Z. ramigera был и остается наиболее широко используемым для экспериментальных исследований в различных областях (8), необходимо составить номенклатурное описание этого нового таксона, чтобы прекратить дальнейшую таксономическую путаницу. Сильное разветвление Z. ramigera IAM 12669 на дереве указывает на то, что данный организм филогенетически отдален от типичных штаммов Zoogloea и принадлежит к общему роду внутри подкласса «а» протеобактерий. Рекомендуется провести повторную классификацию штамма IAM 12669 как уже известного или нового вида агробактерий либо родственных таксонов.
Представители семьи Pseudomonadaceae (25, 26) оказались настолько разнородными, что больше не могут считаться одной семьей. Исследования рибосомной РНК-ДНК гибридизации показывают, что у родов Xanthomonas и Frateuria, являющихся представителями данной семьи, есть дальнее филогенетическое родство с Pseudomonas sensu strict0 внутри подкласса «y» протеобактерий (4-6). Становится очевидным, что отнесение рода Zoogloea к семье Pseudomonadaceae является неверным с филогенетической точки зрения.
Кроме того, исследования гибридизации геномной ДНК показали, что между типичным штаммом Z. ramigera и всеми испытуемыми штаммами зооглей, которым еще не даны специальные названия, существует тесное генетическое родство. Данные штаммы являются гомологичными на 72%. В свете генетической концепции вида, стандартизированной на основе уровней гибридизации ДНК (35), можно сделать вывод, что все данные штаммы зооглей должны рассматриваться как отдельный вид, и в то же время род Zoogloea является монотипичным родом, который включает только один вид Z. ramigera.
До настоящего времени род Zoogloea был описан только на основании фенотипичной информации в рамках морфологии, физиологии и биохимии (33), которая включает активную подвижность, образование хлопьев, производство поли-Р-гидроксибутирата, нитратное дыхание, продуцирование уреазы, гидролиз желатина, а также разложение бензоата путем мета-расщепления кольцевой структуры. Однако некоторые из данных характерных признаков кажутся слишком недостоверными или нечетко выраженными, чтобы быть использованными при определении рода. В параллельно проводимых фенотипичных исследованиях было обнаружено, что активная подвижность, производство поли-Р-гидроксибутирата, гидролиз желатина и продуцирование уреазы у разных штаммов различно или зависит от условий культивирования. Было бы предпочтительнее убрать эти свойства из описания рода Zoogloea. Кроме того, оказалось, что разновидности зооглей, которые не образуют хлопьев, могут встречаться в субкультуре (17, 29). Предыдущее исследование предоставило более ценную информацию об этом роде с хемотаксономической точки зрения (17). В частности производство родохинона может использоваться как отличительный признак в таксономических целях, поскольку наличие данного структурного типа хинона встречается в довольно ограниченном количестве у представителей хемотрофных бактерий (15). Далее в настоящем докладе дана филогенетическая и генотипическая информация, а также указаны пересмотренные данные о составе оснований ДНК. Таким образом, происходит уточнение описания рода Zoogloea на основании собранной и пересмотренной информации, а также некоторых фенотипичных данных, уже известных ранее (33).
Новые ииследования штамма Zoogloea Itzigsohn 1868.
Прямые, слегка изогнутые палочки, 1,0 – 1,3 пм в диаметре, длиной 2,1 – 3,6 пм. Передвигаются посредством единственного полярно расположенного жгутика. Грамотрицательные. Клетки, выращенные в жидкой среде, образуют хлопья или пленки, которые плавают в студенистом межклеточном материале и характеризуются пальцевидной или древовидной морфологией. Иногда встречаются разновидности, не образующие хлопьев. Рост бактерий происходит в минеральной среде с добавлением простых органических соединений, являющимися источниками углерода, а также дрожжевого экстракта в качестве фактора роста, но при добавлении обыкновенного питательного пептона, содержащего агар, рост бактерий замедляется. Непигментированные.
Аэробные хемоорганотрофные организмы со строго дыхательным типом метаболизма, где кислород выступает в качестве конечного акцептора электронов. Анаэробный рост происходит посредством нитратного дыхания; осуществляется денитрификация. Оксидазо-положительный. Каталаза выражена слабо. Из глюкозы и многих других углеводов образование кислот не происходит. Бензоат разрушается мета-расщеплением кольцевой структуры. Основные хиноны - Q-8 и RQ-8. Пальмитолеиновая кислота (C16:l) является основным типом клеточных жирных кислот.
Присутствует 3-гидроксидекановая кислота (3-OH-C10:O) с небольшим количеством 3-OH-Cl2:O. Процент молекулярной массы гуанина и цитозина ДНК колеблется в пределах от 67,3 до 69,0. Филогенетическое положение - подкласс «P» протеобактерий. Среда обитания: загрязненная пресная вода и системы биологической обработки сточных вод. Разновидность: Zoogloea ramigera Itzigsohn 1868.
1. Butterfield, C. T. 1935. Studies of sewage purification. 11. A zoogloea-forming organism found in activated sludge. Public Health Rep. 50:671-684.
2. Crabtree, K., and E. McCoy. 1967. Zoogloea ramigera Itzigsohn; identification and description. Int. J. Syst. Bacteriol. 17:l-10.
3. Deinema, M. H., and L. P. T. M. Zevenhuizen. 1971. Formation of cellulose fibrils by gram-negative bacteria and their role in bacterial flocculation. Arch. Mikrobiol. 78:42-57.
4. De Ley, J. 1992. The Proteobacteria: ribosomal RNA cistron similarities and bacterial taxonomy, p. 2111-2140. In A. Balow, H. G. Truper, M. Dworkin, W. Harder, and K.-H. Schleifer (ed.), The prokaryotes, 2nd ed. Springer-Verlag, New York.
5. De Vos, P., and J. De Ley. 1983. Intra- and intergeneric similarities of Pseudomonas and Xanthomonas ribosomal ribonucleic acid cistrons. Int. J. Syst. Bacteriol. 33:487-509.
6. De Vos, P., M. Goor, M. Gillis, and J. De Ley. 1985. Ribosomal ribonucleic acid cistron similarities of phytopathogenic Pseudornonas species. Int. J. Syst. Bacteriol. 35169-184.
7. Dias, F. F., and J. V. Bhat. 1964. Microbial ecology of activated sludge. I. Dominant bacteria. Appl. Microbiol. 12:412-417.
8. Dugan, P. R., D. L. Stoner, and H. M. Pickrum. 1992. The genus Zoogloea, p. 3952-3964. In A. Balow, H. G. Triiper, M. Dworkin, W. Harder, and K.-H. Schleifer (ed.), The prokaryotes, 2nd ed. Springer-Verlag, New York.
9. Ezaki, T., S. Dejsirilert, H. Yamamoto, N. Takeuchi, S. Liu, and E. Yabuuchi. 1988. Simple and rapid genetic identification of Legonella species with photobiotin-labeled DNA. J. Gen. Appl. Microbiol. 34:191-199.
10, Friedman, B. A., and P. R. Dugan. 1968. Identification of Zoogloea species and the relationship to zoogloeal matrix and floc formation. J. Bacteriol. 951903-1909.
11. Heukelekian, H., and M. L. Littman. 1939. Carbon and nitrogen transformations in the purification of sewage by the activated sludge process. 11. Morphological and biochemical studies of zoogloeal organisms. Sewage Works J. 11:752-763.
12. Higgins, D. G., A. J. Bleasby, and R. Fuchs. 1992. CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment. Comput. Appl. Biosci. 8:189-191.
13. Hiraishi, A. 1992. Direct automated sequencing of 16s rDNA amplified by polymerase chain reaction from bacterial cultures without DNA purification. Lett. Appl. Microbiol. 15210-213.
14. Hiraishi, A., Y. Hoshino, and T. Satoh. 1991. Rhodoferax fernentans gen. nov., sp. nov., a phototrophic purple nonsulfur bacterium previously referred to as the Rhodocyclus gelatinosus- like group. Arch. Microbiol. 155330-336.
15. Hiraishi, A., and K. Komagata. 1989. Isolation of rhodoquinonecontaining chemoorganotrophic bacteria from activated sludge. FEMS Microbiol, Lett. 58:55-58.
16. Hiraishi, A., and K. Komagata. 1989. Effects of the growth medium composition on menaquinone homolog formation in Micrococcus luteus. J. Gen. Appl. Microbiol. 35311-318.
17. Hiraishi, A., Y. K. Shin, J. Sugiyama, and K. Komagata. 1992. Isoprenoid quinones and fatty acids of Zoogloea. Antonie van Leeuwenhoek 61:231-236.
18. Katayama-Fujimura, Y., Y. Komatsu, H. Kuraishi, and T. Kaneko. 1984. Estimation of DNA base composition by high performance liquid chromatography of its nuclease P1 hydrolysate. Agric. Biol. Chem. 48:3169-3172.
19. Kato, A., K. Izaki, and H. Takahashi. 1971. Floc-forming bacteria isolated from activated sludge. J. Gen. Appl. Microbiol. 12439.
20. Kimura, M. 1980. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitution through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 16:111-120.
21. Kiuchi, K., H. Kuraishi, H. Murooka, K. Aida, and T. Uemura. 1968. Floc formation in activated sludge. 11. Identification of twelve representative strains isolated from activated sludge. J. Gen. Appl. Microbiol. 14:399409.
22. MacKinney, R. E., and M. P. Horwood. 1952. Fundamental approach to the activated sludge process. I. Floc-producing bacteria. Sewage Ind. Wastes 24:117-123.
23. Marmur, J. 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3:20&218.
24. Oyaizu-Masuchi, Y., and K. Komagata. 1988. Isolation of freeliving nitrogen fixing bacteria from the rhizosphere of rice. J. Gen. Appl. Microbiol. 34:127-164.
25. Palleroni, N. J. 1984. Family I. Pseudomonadaceae Winslow, Broadhurst, Buchanan, Krumwiede, Rogers and Smith 1917, 555AL, p. 141. In N. R. Krieg and J. G. Holt (ed.), Bergeys manual of systematic bacteriology, vol. 1. The Williams & Wilkins Co., Baltimore.
26. Palleroni, N. J. 1992. Introduction to the family Pseudomonadaceae, p. 3071-3085. In A. Balow, H. G. Triiper, M. Dworkin, W. Harder, and K.-H. Schleifer (ed.), The prokaryotes, 2nd ed. Springer-Verlag, New York.
27. Satiou, N., and M. Nei. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4:406425.
28. Stackebrandt, E., R G. E. Murray, and H. G. Triiper. 1992. Proteobacteria classis nov., a name for the phylogenetic taxon that includes the purple bacteria and their relatives. Int. J. Syst. Bacteriol. 38:321-325.
29. Strand, S. E., A. J. McDonnell, and R. F. Unz. 1988. Oxygen and nitrate reduction kinetics of a nonflocculating strain of Zoogloea ramigera. Antonie van Leeuwenhoek 54:245-255.
30. Tamaoka, J., D.-M. Ha, and K. Komagata. 1987. Reclassification of Pseudomonas acidovorans den Dooren de Jong 1926 and Pseudomonas testosteroni Marcus and Talalay 1956 as Comamonas acidovorans comb. nov. and Comamonas testosteroni comb, nov., with an emended description of the genus Comamonas. Int. J. Syst. Bacteriol. 3752-59.
31. Ueda, S., and R Earle. 1972. Microflora of activated sludge. J. Gen. Appl. Microbiol. 18:239-248.
32. Unz, R. F. 1971. Neotype strain of Zoogloea ramigera Itzigsohn. Int. J. Syst. Bacteriol. 21:91-99.
33. Unz, R. F. 1984. Genus IV. Zoogloea Itzigsohn 1868, 3PL, p. 214-219. In N. R. Krieg and J. G. Holt (ed.), Bergeys manual of systematic bacteriology, vol. 1. The Williams & Wilkins Co., Baltimore.
34. Wattie, E. 1943. Cultural characteristics of zoogloea-forming bacteria isolated from activated sludge and trickling filters. Sewage Works J. 15476-489.
35. Wayne, L. G., D. J. Brenner, R. R. Colwell, P. A. D. Grimont, 0. Kandler, M. I. Krichevsky, L. H. Moore, W. E. C. Moore, R. G. E. Murray, E. Stackebrandt, M. P. Starr, and H. G. Triiper. 1987. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. Tnt. J. Syst. Bacteriol. 37:463464.